Ziehl-Neelsen-Färbung: Grundierung, Reagenzien und Technik

Ziehl-Neelsen-Färbung in einer Färbetechnik zur Identifizierung alkoholsäureresistenter Mikroorganismen (AAR). Der Name dieses mikrobiologischen Verfahrens bezieht sich auf seine Autoren: den Bakteriologen Franz Ziehl und den Pathologen Friedrich Neelsen.

Diese Technik ist eine Art Differenzialfärbung, bei der unterschiedliche Farbstoffe verwendet werden, um einen Kontrast zwischen den Strukturen zu erzeugen, die Sie beobachten, unterscheiden und später identifizieren möchten. Die Ziehl-Neelsen-Färbung dient zur Identifizierung bestimmter Arten von Mikroorganismen.

Einige dieser Mikroorganismen sind Mykobakterien (zum Beispiel Mycobacterium tuberculosis ), Nocardia (zum Beispiel Nocardia sp.) Und einige einzellige Parasiten (zum Beispiel Cryptosporidium parvum ). Viele der Bakterien können durch eine übliche Technik, die Gram-Färbung, klassifiziert werden.

Einige Bakteriengruppen erfordern jedoch andere Methoden, um sie zu identifizieren. Techniken wie die Ziehl-Neelsen-Färbung erfordern Kombinationen von Farbstoffen mit Wärme, um die erste an der Zellwand zu fixieren.

Dann folgt ein Verfärbungsprozess, der zwei Ergebnisse ermöglicht: Beständigkeit oder Empfindlichkeit gegen Verfärbung durch Säuren und Alkohole.

Stiftung

Die Grundlage dieser Färbetechnik sind die Zellwandeigenschaften dieser Mikroorganismen. Die Wand besteht aus einer Art Fettsäuren, die als Mykolsäuren bezeichnet werden. Diese zeichnen sich durch sehr lange Ketten aus.

Wenn Fettsäuren sehr lange Strukturen haben, können sie Farbstoffe leichter zurückhalten. Einige Bakteriengattungen sind aufgrund des hohen Mykolsäuregehalts in der Zellwand durch Gram-Färbung nur sehr schwer zu färben.

In der Ziehl-Neelsen-Färbung wird die Phenolverbindung Carbolfuchsin, ein basischer Farbstoff, verwendet. Dies hat die Fähigkeit, mit den Fettsäuren in der Zellwand zu interagieren, die bei Raumtemperatur eine wachsartige Textur aufweisen.

Der Carbolfuchsin-Fleck wird bei Hitzeeinwirkung verbessert, da das Wachs schmilzt und die Farbstoffmoleküle schneller in die Zellwand gelangen.

Die Säure, die später verwendet wird, dient dazu, die Zellen zu verfärben, die nicht angefärbt wurden, weil ihre Wand nicht ausreichend mit dem Färbemittel verwandt war; daher kann die Stärke des Säureentfärbungsmittels den Säurefarbstoff entfernen. Die Zellen, die dieser Verfärbung widerstehen, werden als säurebeständig bezeichnet.

Sekundäre Färbung

Nach der Verfärbung der Probe wird diese mit einem anderen Farbstoff kontrastiert, der als Sekundärfarbstoff bezeichnet wird. Im Allgemeinen werden Methylenblau oder Malachitgrün verwendet.

Der Sekundärfarbstoff färbt das Hintergrundmaterial und erzeugt folglich einen Kontrast zu den Strukturen, die im ersten Schritt gefärbt wurden. Nur die gebleichten Zellen absorbieren den zweiten Farbstoff (Antifärbung) und nehmen ihre Farbe an, während säurefeste Zellen die Farbe Rot behalten.

Dieses Verfahren wird häufig zur Identifizierung von Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium leprae verwendet, die als säurefeste Bazillen bezeichnet werden.

Reagenzien

Primärfärbung

Carboxin 0, 3% Fuchsin (gefiltert) wird verwendet. Dieser Farbstoff wird aus einer Mischung von Alkoholen hergestellt: Phenol in Ethanol (90%) oder Methanol (95%), und in dieser Mischung werden 3 g basisches Fuchsin gelöst.

Entfärbungslösung

In diesem Schritt können Lösungen von 3% iger Alkoholsäure oder 25% iger Schwefelsäure verwendet werden.

Sekundärfärbung (Antifarbmittel)

Der zur Kontrastierung der Proben am häufigsten verwendete Farbstoff ist üblicherweise 0, 3% Methylenblau. Es können jedoch auch andere verwendet werden, beispielsweise 0, 5% Malachitgrün.

Technik

Säurefeste Färbung

Bereiten Sie einen Bakterienabstrich vor

Diese Vorbereitung erfolgt auf einem sauberen und trockenen Objektträger unter Beachtung der Vorsichtsmaßnahmen für die Sterilität.

Den Abstrich trocknen

Lassen Sie den Abstrich bei Raumtemperatur trocknen.

Probe erhitzen

Die Probe muss erhitzt werden, indem ein Feuer auf den darunter liegenden Objektträger gelegt wird. Eine Fixierung mit Alkohol kann erfolgen, wenn der Abstrich nicht mit Auswurf (mit Natriumhypochlorit behandelt, um ihn aufzuhellen) vorbereitet wurde und wenn er nicht sofort gefärbt wird.

M. tuberculosis wird mit Bleichmittel und während des Färbevorgangs eliminiert. Die Thermofixierung von unbehandeltem Sputum tötet M. tuberculosis nicht ab, während die Fixierung mit Alkohol bakterizid ist.

Decken Sie den Fleck ab

Der Fleck wird mit der Karbolfuchsinlösung (primärer Grundfleck) bedeckt.

Den Fleck erhitzen

Dies dauert 5 Minuten. Sie sollten eine Dampfentwicklung bemerken (ca. 60 ° C). Es ist wichtig, dass die Probe nicht überhitzt und nicht verbrannt wird.

In Bezug auf die Erwärmung des Flecks ist beim Erhitzen des Karbolfuchsins besondere Vorsicht geboten, insbesondere wenn das Färben auf einem Tablett oder einem anderen Behälter durchgeführt wird, in dem leicht entzündliche Chemikalien aus dem vorherigen Fleck gesammelt wurden.

Unter den Objektträgern sollte nur eine kleine Flamme mit einem brennenden Tupfer angebracht werden, der zuvor mit einigen Tropfen saurem Alkohol, Methanol oder 70% igem Ethanol angefeuchtet wurde. Vermeiden Sie die Verwendung eines großen, in Ethanol getränkten Tupfers, da dies eine Brandgefahr darstellt.

Waschen Sie den Fleck

Diese Wäsche sollte mit sauberem Wasser erfolgen. Wenn das Leitungswasser nicht sauber ist, waschen Sie den Abstrich vorzugsweise mit gefiltertem oder destilliertem Wasser.

Bedecken Sie den Abstrich mit saurem Alkohol

Dieser saure Alkohol sollte 3% betragen. Die Abdeckung erfolgt für 5 Minuten oder bis der Abstrich ausreichend verfärbt ist, dh blassrosa.

Es ist zu beachten, dass saurer Alkohol brennbar ist; Daher muss es sehr vorsichtig verwendet werden. Vermeiden Sie die Nähe von Zündquellen.

Waschen Sie den Fleck

Die Wäsche sollte mit sauberem, destilliertem Wasser erfolgen.

Bedecken Sie den Abstrich mit Farbstoff

Es kann grüner Malachit (0, 5%) oder Methylenblau (0, 3%) für 1 oder 2 Minuten sein, wobei die längste Zeit verwendet wird, wenn der Abstrich dünn ist.

Waschen Sie den Fleck

Sauberes Wasser muss wieder verwendet werden (destilliert).

Abtropfen lassen

Die Rückseite des Objektträgers sollte gereinigt werden, und der Fleck sollte an der Luft getrocknet werden (kein saugfähiges Papier zum Trocknen verwenden).

Untersuche den Abstrich im Mikroskop

Das 100X Objektiv und das Immersionsöl sollten verwendet werden. Scannen Sie den Abstrich systematisch und notieren Sie die relevanten Beobachtungen.

Interpretieren Sie die Ergebnisse

Theoretisch gelten rötlich gefärbte Mikroorganismen als säurefest positiv (AAR +).

Färben sich die Mikroorganismen dagegen je nach dem als Gegenfarbstoff verwendeten Farbstoff blau oder grün, gelten sie als alkoholresistente Säure (AAR-).